Provas de Coagulação – TP ( Tempo de Protrombina) e técnica

Equipamento automatizado para provas de coagulação

Equipamento automatizado para provas de coagulação

 

TP – Tempo de Protrombina

Este teste mede o mecanismo extrínseco da coagulação, que é o tempo necessário para que o plasma coagule na presença de fator tecidual (tromboplastina) e cálcio.

O complexo formado entre o fator tecidual, o fator VII plasmático e o cálcio, ativa diretamente o fator X da via comum levando a formação de fibrina.

O resultado pode ser expresso em atividade de protrombina, se utilizada uma tabela de conversão do tempo de protrombina em atividade de protrombina (%) ou através do INR (razão internacional normatizada).

O INR é um fator calculado através da relação TP paciente/ TP controle elevado ao índice internacional de sensibilidade.

A grande maioria dos laboratórios utilizam equipamentos automatizados ou semi-automatizados para a medição do TP. Porém em alguns casos pode haver necessidade de fazê-lo manualmente conforme a técnica à seguir:

* em um tubo de hemólise colocar 0,2mL de tromboplastina cálcica (também conhecida como tromboplastim (nome comercial)), aquecer em banho maria a 37ºC por aproximadamente 1 minuto e em seguida adicional 0,1mL de plasma ciotratado (sangue colhido em tubo azul citratado e centrifugado por 10 minutos a 3.000 RPM). Acionar o cronômetro e anotar o tempo decorrido para a formação do coágulo. A posição correta para a visualização do coágulo é manter o tubo contra um fundo escuro e um pouco acima da linha de visão.

O valor de referência é de 10 – 14 segundos. Porém esse valor pode ser modificado dependendo do tipo de população, tipo de tromboplastina, tipo da instrumentação utilizad, pH e grau de pureza da água destilada.

A interpretação:

O TP está aumentado nas deficiências congênitas dos fatores da via extrínseca (fator VII) e via comum, nas doenças hepáticas, na deficiência de vitamina K, na presença de fibrinólise primária e na coagulação intravenosa disseminada.

Muito utilizado para a monitorização do uso de anticoagulantes orais, por exemplo os cumarínicos (varfarina) que atuam na inibição a carboxilação do ácido glutâmico presente nos fatores de vitamina K dependentes ( fator II, VII, IX, X e proteínas anticoagulantes C e S).

A diminuição da inibição a carboxilação do ácido glutâmico resulta em atividade prejudicada pela incapacidade de ligar cálcio.

Algumas drogas podem potencializar os efeitos dos dicumarínicos tais como o álcool etílico, esteróides anabolizantes, antidepressivos tricíclicos, heparina. As sulfonamidas, penicilinas, glucagon ou hormônio tireoidano , também potencializam os efeitos do TP. Já os corticoesteróides, estrógenos, contraceptivos orais ou fenobarbital podem minimizar o efeito anticoagulante.

Diagnóstico do vírus Ebola

Filoviridae. Ebolavirus Fonte: CDC

Filoviridae. Ebolavirus
Fonte: CDC

Um indivíduo que tenha sido infectado recentemente pelo vírus Ebola tem difícil diagnóstico em razão dos sintomas apresentados. Olhos avermelhados e rush cutâneo não são sintomas específicos do vírus e são frequentemente vistos em indivíduos infectados.

Assim que diagnosticado a infecção, o indivíduo deve ser mantido em isolamento e as autoridades notificadas. Amostras de sangue são coletadas e dos testes à seguir são os mais utilizados.

Tabela de diagnostico do Ebola virus

Tabela de diagnostico do Ebola virus

Fonte: http://www.cdc.gov/vhf/ebola/diagnosis/index.html

EBOLA, o vírus que mata 90% dos infectados.

Filoviridae Ebola

Filoviridae. Microscopia eletrônica

A febre hemorrágica causada pelo vírus Ebola, é uma das numerosas febres virais hemorrágicas. Trata-se de uma febre extremamente severa que é frequentemente fatal em humanos e primatas (tais como macacos, gorilas e chimpanzés).

A febre hemorrágica é causada pela infecção do vírus da família Filoviridae, gênero Ebolavirus. Quando a infecção acontece, os sintomas iniciam abruptamente. A primeira espécie de Ebolavirus foi descoberta em 1976 no país que agora é chamado República Democrática do Congo, próximo ao rio Ebola. Desde então, os surtos aparecem esporadicamente.

Existem 5 espécies identificadas do Ebolavirus . Quatro das cinco espécies causam a doença em humanos. Ebola virus (Zaire ebolavirus); Sudan virus (Sudan ebolavirus); Taï Forest virus (Taï Forest ebolavirus, antigamente Côte d’Ivoire ebolavirus); e Bundibugyo virus (Bundibugyo ebolavirus).

O hospedeiro que é reservatório natural dos vírus ainda é desconhecido, porém uma das bases de evidências disponíveis e a natureza de outros vírus similares, são acreditados como uma doença potenciamente zoonótica tendo possivelmente morcegos como hospedeiros primários. Quatro das cinco espécies ocorrem em animais nativos da África.

O hospedeiro de espécies similares é provavelmente associada ao Reston virus, que foram isolados de espécies de macacos cynomolgous, trazidos dos Estados Unidos e Italia vindos das Filipinas.

Como é transmitido?

Quando a infecção acontece, existem diversas maneiras em que o vírus pode ser transmitido:

  • contato direto com o sangue  ou secreções da pessoa contaminada;
  • contato com objetos contaminados por secreções do infectado (por exemplo: colheres, copos…).

 

 

Quais são os sinais e sintomas?

No início os sintomas não são específicos, o que dificulta o diagnóstico.

 

Os sintomas da febre hemorrágica Ebola são tipicamente:

  • febre
  • dor de cabeça
  • dores nas articulações e músculos
  • fraqueza
  • diarréia
  • vômitos
  • dor de estômago
  • perda do apetite

Alguns infectados podem apresentar:

  • rash cutâneo
  • olhos vermelhos
  • soluços
  • tosse
  • garganta inflamada
  • dor no peito
  • dificuldade na respiração
  • dificuldade na deglutição
  • hemorragias dentro e fora do corpo

Os sintomas podem aparecer de 2 a 21 dias após a exposição e tem uma duração de 8 a 10 dias, mais comumente.

 

 

Fonte: http://www.cdc.gov/vhf/ebola/

Onde atua o Biomédico em Reprodução Humana

LOGO BIOMEDICO

O Biomédico que deseje atuar em Reprodução Humana pode desenvolver as seguintes tarefas:

 

  • Atuar em Identificação e Classificação oocitária; Processamento Seminal; Espermograma; Criopreservação Seminal; Classificação embrionária; Criopreservação Embrionária; Biópsia Embrionária e Hatching;
  • Atuar em Embriologia. Realizar a manipulação de gametas (oócitos e espermatozóides) e pré-embriões.

Fonte: http://crbm1.gov.br/atuacao-do-biomedico/

Técnica de Coloração de Papanicolau

Dentro das atribuições do Biomédico, temos a coleta de citologia esfoliativa ou Papanicolau.

O método de Papanicolau utiliza um conjunto de corantes e tem como objetivo a evidenciação das variáveis na morfologia e dos graus de maturidade de  atividade metabólica celular. Esse método se baseia nas ações  de um corante básico (com afinidade pelo núcleo das células: a hematoxilina), um corante ácido (que se combina com o citoplasma das células queratinizadas: orange G) e um corante policromático (que oferece tonalidades de cores diferentes no citoplasma das células: EA-65).

Este método abrange cinco etapas:
• Hidratação: esta etapa requer a reposição, gradual da água das células por meio de banhos alcoólicos de concentrações  decrescentes até  a água destilada;

• Coloração nuclear: as células hidratadas podem agora receber um corante aquoso para corar os núcleos (hematoxilina de Harris).

• Desidratação: para receber corantes alcoólicos citoplasmáticos, devemos agora retirar a água das células com banhos alcoólicos de concentrações crescentes.

• Coloração citoplasmática: nesta etapa, o citoplasma das células é corado pelos corantes Orange G e EA-65, de modo a diferenciar com várias tonalidades o citoplasma das células de acordo com a sua maturidade e metabolismo.

• Desidratação, clarificação e selagem: a água agora deve ser retirada com concentrações alcoólicas crescentes, clarificadas e seladas com meios permanentemente hidrofóbicos.

Fonte: http://www.epsjv.fiocruz.br/upload/d/capitulo_4_vol2.pdf

TÉCNICAS PARA A COLORAÇÃO: Imergir as lâminas em análise em cubas de
coloração contendo as soluções na sequência abaixo discriminadas, devidamente identificadas, respeitando-se o tempo determinado.
CUBA                        Nº                                                                              REATIVO TEMPO
1                                  Etanol a 99%                                                         2 minutos
2                                  Etanol a 70%                                                        2 minutos
3                                  Etanol a 50%                                                        2 minutos
4                                  Água destilada                                                    2 minutos
5                                  HEMATOXILINA DE HARRIS (Nº 1)         45 segundos
6                                  Água corrente                                                    10 minutos
7                                 Etanol a 50%                                                        2 minutos
8                                 Etanol a 70%                                                        2 minutos
9                                 Etanol a 80%                                                        2 minutos
10                              Etanol a 99%                                                         2 minutos
11                              ORANGE G6 (Nº 2)                                             2 minutos
12                              Etanol a 99%                                                         2 minutos
13                              Etanol a 99%                                                         2 minutos
14                              EA-36 (Nº 3)                                                         2 minutos
15                             Etanol a 99%                                                          2 minutos
16                             Etanol a 99%                                                          2 minutos
17                            Etanol a 96%                                                          2 minutos
18                            Xilol                                                                           2 minutos
19                            Xilol                                                                           2 minutos
20                           Montagem com Bálsamo do Canadá.

OBSERVAÇÕES:
O tempo da Hematoxilina de Harris de 45 segundos, nem sempre dá resultado
satisfatório, portanto quando necessário, deverá ser ajustado.
Deve-se eliminar os excessos das soluções quando se passa de uma cuba para
outra, menos na passagem da Hematoxilina para água corrente que deve ser
imediata.
Os corantes devem ser renovados mensalmente.
Os corantes devem ser filtrados regularmente.

São admitidas variações e adaptações durante o processo de coloração.

Cortando o mal pela raiz

Pesquisadores usam proteína de bactéria para remover o vírus HIV escondido no DNA de pacientes com Aids. A estratégia, testada apenas em laboratório, erradica o vírus latente e impede novas infecções, mas ainda não é totalmente segura.

Por: Sofia Moutinho

Publicado em 21/07/2014

Testada em células do cérebro, nova estratégia de terapia genética erradica a infecção latente pelo HIV. Na foto, os vírus (em amarelo) infectam uma célula do sistema imune humano. (foto: National Institutes of Health (NIH))

Testada em células do cérebro, nova estratégia de terapia genética erradica a infecção latente pelo HIV. Na foto, os vírus (em amarelo) infectam uma célula do sistema imune humano. (foto: National Institutes of Health (NIH))

Os medicamentos antirretrovirais têm sido a principal ferramenta de combate à Aids. Segundo o recém-divulgado relatório do Programa das Nações Unidas para Aids(Unaids), até o final de 2012, cerca de 9,7 milhões de pessoas tiveram acesso à terapia e a meta é que 15 milhões de pacientes estejam cobertos até 2015 – atualmente estima-se que haja 16 milhões de pessoas diagnosticadas.

O tratamento farmacológico, no entanto, não se mostrou capaz de eliminar por completo a infecção pelo HIV, pois não age sobre os vírus latentes, que ficam silenciosamente integrados ao DNA humano e podem ser reativados a qualquer momento. Pesquisadores agora se valem de uma proteína bacteriana para fazer ‘microcirurgias’ no genoma e extirpar o vírus invasor.

A proteína usada é a Cas9, responsável pelo ‘sistema imune’ das bactérias. Ela corta fragmentos de material genético de vírus invasores e os incorpora ao DNA bacteriano. Quando a bactéria cruza novamente com o vírus que contém aquela sequência genética, o identifica como inimigo e o ataca. Essa habilidade tem sido aproveitada por pesquisadores para modificar trechos de DNA humano. Acoplada a uma molécula de RNA criada em laboratório que lhe serve como guia até segmentos específicos do genoma, a proteína Cas9 se direcionada a uma sequência de DNA equivalente à representada pelo RNA e a corta fora.

No início do ano, pesquisadores da Universidade da Pensilvânia (EUA) usaram a Cas9 para modificar o receptor celular CCR5, ao qual o vírus HIV se liga para entrar nas células do sistema imune humano. Com a intervenção, as células de 12 pacientes passaram a ficar resistentes ao HIV, o que impede uma infecção inicial, mas não resolve o problema dos vírus escondidos, já instalados e misturados ao DNA humano.

Hoje, pesquisadores da Universidade Temple (EUA) publicaram um artigo no periódico científico PNAS em que relatam ter usado a Cas9 para atingir diretamente os vírus HIV latentes em células do cérebro in vitro. Acoplada a um pedaço de RNA guia, a proteína ‘deletou’ partes importantes do vírus, erradicando-o do genoma humano e impossibilitando a sua reativação – tudo isso sem prejudicar o DNA do paciente, que foi reparado pelo próprio organismo.

A proteína Cas09 é acoplada a uma tira da RNA que serve como guia e se une apenas a uma sequência de DNA equivalente à do RNA. Quando a sequência é encontrada, a Cas9 abre a dupla hélice do DNA e corta fora o material genético viral. (montagem: Sofia Moutinho)

A proteína Cas09 é acoplada a uma tira da RNA que serve como guia e se une apenas a uma sequência de DNA equivalente à do RNA. Quando a sequência é encontrada, a Cas9 abre a dupla hélice do DNA e corta fora o material genético viral. (montagem: Sofia Moutinho)

 

Segundo os cientistas, a estratégia, ainda não testada em pacientes, funciona não só para acabar com uma infecção já existente por HIV, como também para evitar novas. Ao menor sinal de tentativa de integração do material genético do vírus HIV com o DNA humano, a proteína Cas9 entra em ação destruindo o invasor.

“Podemos explorar vários sistemas e rotas para aplicar a Cas9 em indivíduos já infectados com o HIV e também para imunizar indivíduos de grupos de risco”, dizem os autores no artigo da PNAS.

Promissora, mas não prática

O geneticista Renato Santana, que conduz pesquisas de combate ao HIV com terapia genética na Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), pontua que a nova abordagem é “extremamente relevante e de fácil manipulação no laboratório”, mas ressalta que ainda é necessário desenvolver métodos eficientes de aplicação da estratégia nos pacientes.

Uma das possibilidades seria injetar a proteína Cas9 acoplada ao RNA diretamente na medula óssea, importante reservatório de vírus latentes e fábrica de células sanguíneas. Mas o procedimento não é trivial.

“A entrega da Cas9 nas células ainda é complicada; a repopulação da medula é um procedimento custoso, que requer muito cuidado e não é viável como estratégia de tratamento de grande abrangência entre a população”, pondera Santana. “A abordagem pode ser boa a longo termo, mas, a curto prazo, as estratégias farmacológicas ainda são mais plausíveis.”

Santana: “A abordagem pode ser boa a longo termo, mas, a curto prazo, as estratégias farmacológicas ainda são mais plausíveis”

O pesquisador nota ainda que, antes de se pensar no uso dessa terapia, é preciso garantir que a estratégia seja segura. Um dos perigos é que a Cas9 corte não só o genoma viral, mas sequências relevantes do DNA do paciente. “Várias partes do nosso genoma são oriundas de vírus inseridos em nossas células há milhares de anos e elas controlam processos relevantes ao desenvolvimento celular, como o transporte de colesterol e a formação da placenta”, explica Santana.

Para o pesquisador, as estratégias que miram na reprogramação das células para torná-las resistentes ao HIV são mais seguras por enquanto. Em seu laboratório, Santana e colegas trabalham nessa linha e desenvolvem uma abordagem que impede a entrada do HIV nas células e, ao mesmo tempo, destrói os vírus que conseguirem entrar. “Estamos tentando tornar as células duplamente resistentes”, diz Santana. “Modificamos o receptor CCR5 para que o vírus não entre e, se ele escapar, uma proteína entra em ação e modifica o vírus, tornando-o inativo.”

Por outro lado, o grupo da Universidade Temple destaca que sua pesquisa com a Cas9 está em plena ascensão e evolui rapidamente, de modo que a abordagem proposta tende a ficar cada vez mais próxima da aplicação clínica. “A edição genômica por Cas9 tem mostrado uma eficácia promissora e suas propriedades podem fornecer um caminho viável para uma cura permanente da Aids e outros vírus patogênicos”, concluem os pesquisadores no artigo da PNAS.

Segundo o novo relatório da Unaids, estima-se que existam 35 milhões de pessoas infectadas com HIV no mundo, das quais 19 milhões não foram diagnosticadas. Apesar de apresentar queda global, a taxa de novas infecções pelo vírus da Aids aumentou 11% no Brasil entre 2005 e 2013, impulsionada principalmente pela maior transmissão da doença entre indivíduos de grupos de risco, como homens homossexuais.

Sofia Moutinho
Ciência Hoje On-line